Da antworte ich doch gerne drauf:
Die Größe des Bildausschnittes ist nur abhängig davon was du mit dem Laser im Mikroskop beleuchten kannst, wir haben bei uns ungefähr 17,5µm x 34µm Field of view. Man kann so ab 10000 Einzel-Blink-Bildern eine vernünftige Rekonstruktion erreichen, besser sind aber 20000 – kommt halt stark auf die Strukturen an. Letzteres dauert ca. 10 Minuten. Bei 3D ist man recht beschränkt, mit der Zylinderlinse, wie ich es beschrieben habe, hast du nur die Chance 1µm in z aufzunehmen, mit einer Messung. Du kannst aber meistens dann nicht noch höher gehen um “mehr z” aufzunehmen, da haben die Farbstoffe schon ziemlich gelitten und blinken nicht mehr so toll. Photobleaching ist im Prinzip ein Problem, man kann sagen, dass eine Stelle, an der man gemessen hat, nach dieser Messung “tot” ist. Man kann von dort noch Signal bekommen, aber eine schöne Rekonstruktion sieht definitiv anders aus.
Photobleaching ist “nur” im Prinzip ein Problem, weil dieser dSTORM Puffer auf den Prinzipien von ROXS beruht – das würde auch nicht anders gehen, wir leuchten unser Field of View mit einer Laserleistung von 150mW aus, das entspricht einer Leistungsdichte von ungefähr 5kW/cm^2. Das dieser Blinkeffekt eintritt beruht zum Teil auch dem Pfad, der die Farbstoffe zum Photobleichen bringt. Mit normaler Fluoreszenzmikroskopie haben unsere Leistungen und Pufferbedingungen kaum noch was zu tun.
Ich hoffe das beantwortet deine Fragen!